Осенний армейский червь, Spodoptera frugiperda, является одним из самых важных вредителей кукурузы, который недавно вторгся в Китай.Для определения эффекта контроля Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) на личинки SВ результате исследований, проведенных с использованием методов биоанализа и полевых испытаний эффективности, была выявлена инсектицидная активность и биоконтрольный эффект AcMNPV на S. frugiperda.Результаты показали, что медианная смертельная концентрация (LC50) AcMNPV, действующего на 2ндИнстар личинки S.Frugiperda была 2,9x 107PIB/mL. Средняя эффективность контроля7PIB/mL AcMNPV+Bt суспензия ((1500 mL/hm2) на S. frugiperda составил 68,99% на 10Второйи 66,87% на 15ВторойНаконец, программное обеспечение DNAMAN 6.0 было использовано для определения гомологии ДНК мертвых насекомых, и результаты показали, что полиэтилен,последовательности леф-8 и леф-9 генов последовательности мертвого насекомого и S.Frugiperda были на 100% идентичныВсе вышеперечисленные результаты могут подтвердить, что AcMNPV может играть ключевую роль в борьбе с S.Frugiperda.7ВВП/мл AcMNPV+Btсуспензия (1500 мл/ мкм)2) следует применять в пик появления молодых личинки S.frugiperda и после 16:00 - 17:00 в солнечный день, чтобы избежать воздействия высокой температуры и света,так что вирусный препарат может играть более важную роль и улучшить свой эффект контроля на S- Фруктовый пирог.
AcMNPV; Spodoptera frugiperda; Lepidopteranpest; larval; биопестицид;AcMNPV+Bt Суспензия; инсектицидная активность; экологическая профилактика и контроль
Spodoptera frugiperda - это всеядный мигрирующий вредитель, который впервые вошел в Китай из Мьянмы в 2019 году и быстро распространился на 1518 районов в 26 провинциях и муниципалитетах Китая.представляют серьезную угрозу продовольственной безопасности КитаяДо сих пор, в стратегии борьбы с армейским червям, борьба с вспышкой армейского червя по-прежнему зависит от интенсивного использования химических пестицидов.Чрезмерное использование химических пестицидов может легко вызвать устойчивость вредителейВ связи с этим ряд серьезных проблем серьезно ограничили устойчивое развитие современного сельского хозяйства.использование биологических методов борьбы или замены биопестицидами;Использование пестицидов для борьбы с армейскими червями становится все более важным и привлекает все больше внимания.
Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus AcMNPV - это многозернистый встроенный вирус ядерного полиэдроза, изолированный из личинки аргирийской люцерны.Он может перекрестно заражать более 30 видов вредителей лепидопторов, таких как мотылёк свеклы., капустной мотыльки, Argyria argyra и Calyptera teristoides,Смешанный тип с Bt и другими инсектицидами и нецелевыми вирусами вредителей в качестве синергетиков имеет очевидное синергетическое воздействие на многих вредителей NoctuidaeAcMNPV - это новый биопестицид вируса насекомых, разработанный компанией Wuhan Unioasis Biological Technology Co., LTD.Это сочетание вируса ядерного полиэдроза аргирии люцерны и синергиста мощного вируса Bt.С хорошей инсектицидной активностью А широко применяется в овощах, фруктовых деревьях, рисе и других областях. the insecticidal activity and biocontrol effect of Autographa californica mul-tiple nucleopolyhedrovirus(AcMNPV) against Spodoptera frugiperda were detected and evaluated by laboratory activity assay and field experiment, с целью предоставления данных, подтверждающих широкое применение вируса ядерного полиэдроза при биологическом контроле Spodoptera frugiperda в кукурузе.Он обеспечивает теоретическую основу для регистрации и применения суспензионного агента AcMNPV плюс Bt при борьбе с армейским червяком..
Вирус, испытанный, был Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) 20 мая 2019 года Spodoptera frugiperda была собрана с кукурузного поля в городе Сиантао, провинция Хубэй,и скрининговый тест на вирусную инфекцию был проведен в лаборатории Wuhan Unioasis Biological Technology Co.., LTD. (в котором Autographa Californica multiplenucleopolyhedrovirus AcMNPV имеет высокую инфекционную активность против Spodoptera frugiperda),Личинки Spodoptera frugiperda были выращены для размножения и размножения.Мертвые личинки, инфицированные вирусом, измельчались водой, фильтровались через 3 слоя марли, и фильтрат центрифугировался при 600 р/мин и 300 р/мин.10Вирусное полиэдро на миллилитр ((Polyhedralinclusionbody PIB), то есть получить чистый технический класс вируса полиэдроза ((1.8 x 1010PIB/mL), консервируются при низкой температуре и откладываются.
Испытуемым биологическим агентом был Autographa california nuclear polyhedrosis.Bacillus thuringiensis, сокращенно AcNPV.Bt ((1.0 * 107 PIB/mL).LTD и производится ее дочерней компанией Wuhan Chuqiang Biological Technology Co.., LTD.
20 июля 2019 года личинки Spodoptera frugiperda были собраны с летнего кукурузного поля в деревне Банкьяо, город Дачанчжэнь,Округ Тонгшань, провинции Хубэй, и вернули в лабораторию Научно-исследовательского института защиты почв и удобрений в Академии сельскохозяйственных наук Хубэй.Свежие и нежные кукурузные листья кормили одной головой в одноразовых пластиковых емкостях Петри (диаметр 8 см)Условия кормления в помещении были: 25±1 °C и относительная влажность 60%-70%, фотопериод 16L:8D. После нескольких поколений размножения,свежие и стерилизованные яйцеклетки хранятся для использования.
Шесть градиентов концентрации, 1,0 * 109, 1,0 * 108, 1,0 * 107, 1,0 * 106, 1,0 * 105, 1,0 * 104Во-первых, ТК AcNPV был разбавлен до 1,0 * 10.9ПИВ/мл, а затем разбавляли в 10 раз для получения других разбавителей с различными концентрациями.Эксперимент проводился с использованием контрольного блока.В общей сложности было выполнено 7 процессов,каждый процесс повторяется 3 раза.
Принят метод кормления листовыми сегментами, т. е. молодые листья свежей кукурузы (длина 2 см * ширина 2 см) сначала обрабатывались спреем с вирусной суспензией, затем личинки кормили,и одиночные головы кормили в чашках ПетриПодарочные полосы были: температура (25±1) °C, фаза-влажность (60% ~ 70%), фотопериод (16L:8D). После употребления в пищу токсичных кукурузных листьев, свежие нетоксичные кукурузные листья должны быть добавлены немедленно.48 личинки второго этапа армейского червя были подвергнуты повторному лечению.Ссылка часть 9{9-11}, Учитывая изменения распространения вируса в клетках и хозяевах семейства мотылёв,количество погибших насекомых из-за вируса и общее количество погибших насекомых было исследовано через 7 и 10 дней после заражения, и была рассчитана смертность и LC50.
Полевое испытание эффективности было проведено в летнем кукурузном поле села Сяоюань, город Чуанван, округ Тонгшань, провинция Хубэй.２, тип почвы - кальциевая почва, значение pH - 6.8, содержание органического вещества составляет 13,9%, а урожайность средняя или высокая. Кукуруза сеется круглый год, а сорт кукурузы - Xiyu No 3.2020, 45% комбинированного удобрения 750 кг/хм２С 2019 года в этом поле произошло серьезное заболевание осенним армейским червяком.
В общей сложности 10 миллионов суспензий AcMNPV.BT (1500 мл/ мм).2Индокарбная суспензия (300 мл/ мм).2Каждое лечение повторялось 4 раза, в общей сложности 12 экспериментальных участков, каждый из которых занимал площадь 100 м2.2
Во второй половине дня 26 августа 2020 года (когда личинки Spodoptera frugiperda встречаются часто), распылите пестицид один раз вечером.Используется электрический спрей для многофункционального рюкзака Lebang марки 3WBJ-16DZДни применения пестицидов солнечные, температура 23-32 °C.Проведение опросов 1В ходе расследования из каждого участка было взято 10 пунктов случайного отбора проб, и 10 растений были непрерывно обследованы в каждом пункте,всего 100 растенийКоличество живых насекомых, смертей, отравлений и естественных врагов на каждом кукурузном растении было зарегистрировано.
Уменьшение количества насекомых = ((количество живых насекомых до нанесения - количество живых насекомых после нанесения) /количество живых насекомых до нанесения)
Эффект профилактики и борьбы=(Уменьшение количества насекомых в зоне обработки-Уменьшение количества насекомых в зоне контроля)/(100-Уменьшение количества насекомых в зоне контроля) *100%
1) Образцы испытуемого вируса. Выберите материнский спирт ACMNPV для определения активности в помещении (образец 1), биологический препарат 10 миллионов ACMNPV.Bt SC (образец 2),трупы инфицированных вирусом насекомых после полевых испытаний эффективности (образец 3), и личинки второго поколения армейского червя, инфицированных трупами насекомых, собранные в образце 3 (образец 4) в качестве образцов тестируемого вируса, для проверки наличия AcMNPV в 10 миллионах ACMNPV.Bt обладает бактерицидной активностью против личинки осеннего армейского червя.
2) Экстракция ДНК. Возьмите 1,0 мл образца AcMNPV, добавьте 99,0 мл дистиллированной воды и тщательно осциллируйте в течение 1 минуты. После осцилляции возьмите 300 мкл суспензии, добавьте 100 мкл раствора щелочного крекинга,водяная ванна при 37 °C в течение 30 минут. Добавить 200μL Tris·HCl буфера и центрифугировать при 10000 р/мин в течение 8 минут. Положить наднатант в центрифугирующую трубку, добавить 5μL протеазы K и 60μL SDS, водяную ванну при 65 °C в течение 2 часов,удалять и охлаждать до комнатной температурыДобавить 650μL Mix L Tris насыщенного фенола, центрифугировать при 10000 р/мин в течение 5 минут, и поместить сверхноситель в новую центрифугу.Добавить 650μL смешанной жидкости фенола и хлороформа (соотношение объемов 1Добавьте 650μL смешанной жидкости хлороформа и изоамилового спирта (соотношение объема 24:1),центрифугировать при 10000 р/мин в течение 5 минут, и наконец, поместить сверхнатант в новую центрифугу, измерить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
3) Усиление ПЦР. Использование стандартной системы сверхсмешивания Т3: ДНК образца 2 мк л. 0,5 мк л праймера до и после, Т3 сверхсмешивания 18 мк л и ddH2O7 мк л. Условие усиления ПЦР 95 °C.После 3 минут предварительной денатурации, выполняются следующие циклы: 98 °C в течение 15 секунд, 52 °C в течение 20 секунд, 72 °C в течение 20 секунд и, наконец, 72 °C в течение 5 минут, в общей сложности 42 цикла.
4) Электрофорез гелем агарозы ДНК. Возьмите продукт амплификации ПЦР 2μL и 5 kb ДНК маркер и поместите в гель агарозы, и электрофоретик при 180 В в течение 20 мин. После электрофореза,наблюдать продукты ПЦР в системе гелевой визуализации.
Полевой праймер вверх по течению
ГГГТТСССССССССССССССССССС
Полевые основополагающие:
ГАГГГАТАТТТГАГГГГГГГ-ГАГГАГ-ГАГГ
Леф-8 вверх по течению:
AGGGTTTCCCAGTCCACGCACGGGAAAT-ГАК
Леф-8 внизу по течению:
ГАГГГАТАТТГАГАТТГАГТГАГТГГГГГГ
ЛЕФ-9 вверх по течению
АГГГТТЦЦАГГГАААААГГГГГГГГ
Леф-9 внизу по течению:
ГАГГГАТАТТГАГГАТТГАГГАГ
Наконец, используйте программное обеспечение DNAMAN6.0 для сравнения измеренных последовательностей polh, lef-8 и lef-9.
Экспериментальные данные были обработаны с использованием программного обеспечения статистического анализа данных IBM SPSS 22.0.
В эксперименте по определению вирусной инсектицидной активности подсчитывается количество мертвых и живых насекомых, обработанных с каждой концентрацией,и рассчитывается уровень смертности и скорректированный процент смертностиКонцентрация каждой обработки преобразуется в значения lg.Уравнение регрессии вирулентности (напряжение ± SE) рассчитывается с использованием рабочих значений вероятности и весов., и LC50Значение и его предел доверия 95%, и, наконец, выполнять тест chi-квадрат(2В полевом эксперименте с эффектом контроля было подсчитано количество живых насекомых в каждой обработке, была вычислена скорость сокращения вредителей.Эффект управления был рассчитан с помощью формулы редактирования Microsoft ExcelДля анализа использовался метод Дункана, а для сравнения значительных различий между методами лечения использовалась односторонняя ANOVA.
Графики в тексте были созданы с помощью программного обеспечения Microsoft Excel.
Результаты испытаний на активность в помещении (таблица 1) показывают, что после 7 дней лечения LC50Количество действий AcMNPV на личинки второго этапа Spodoptera frugiperda составляет 4,1x107ВВП/мл, и LC90равна 1,05 x 108После 10 дней лечения LC50Уровень воздействия AcMNPV на личинки второго этапа составляет 2,9x107ВВП/мл, и LC90равен 7,8х107ВВП/мл. ЛК50и LC90показатели воздействия AcMNPV на личинки второй ступени осеннего армейского червя после 7 дней лечения были выше 10 дней,указывающее на то, что AcMNPV продемонстрировал хорошую инсектицидную активность против личинки Spodoptera frugiperda на 7-й день.
Результаты полевых испытаний эффективности показали, что 10 миллионов AcMNPV.2Средний контрольный эффект на 1, 3 и 5 день после распыления составил 11, 57%, 16, 23% и 15, 56%, соответственно.Средний контрольный эффект на седьмой день после распыления составил всего 21 мг.Однако на 10-й день после распыления эффект борьбы с насекомыми внезапно увеличился до 68,99%, а средний эффект борьбы на 15-й день после распыления также составил 66,87%.В сравнении с химическими агентами Эмамектин Бензоат+ Индоксаир Кондиционирование2В среднем контрольный эффект на 1, 3, 5 и 8 июля был выше, чем на 1 июля.и на седьмой день после приема лекарств было 91Однако средний контрольный эффект на 10-й день начал снижаться, до 67, 63%.и средний контрольный эффект на 15- й день снизился до 51Подробности см. в таблице 2.
В то же время мы также обнаружили, что уменьшение числа насекомых в контрольной зоне было отрицательным на 1-й, 3-й и 5-й день после лечения, что указывает на увеличение числа насекомых.На седьмой день после лечения, он начал становиться положительным (популяция насекомых начала уменьшаться). средний уровень уменьшения насекомых на 10-й и 15-й день составил 38,25% и 47,00% соответственно,что, скорее всего, связано с тем, что некоторые личинки spodoptera frugiperda начали пупаться в почве и поколения перекрывались через 10-15 дней..
В итоге можно увидеть, что 10 миллионов AcMNPV.2При этом его действие медленно, а его эффективность составляет около 10-15 дней после применения.
В ходе полевых экспериментов также были исследованы эффекты 10 миллионов AcMNPV. Bt суспензии на естественных врагов вредителей кукурузы, таких как пауки, бабочки и жуки.Результаты показали, что 10 миллионов AcMNPV. Bt суспензия не имела значительного ущерба для естественных врагов, таких как пауки, бабочки и жуки, со средним числом естественных врагов 13,4 на 100 растений.химические агенты Emamectin Benzoate+ Indoxair Conditioningarb 15% суспензия имели значительное токсическое воздействие на естественных врагов, таких как пауки.В первый день после лечения среднее количество естественных врагов на 100 кукурузных растениях составляло всего 3.1На третий день после лечения было обнаружено только 5,2 естественных противника различных типов (рисунок 1).Bt-суспензия обладает хорошим защитным действием против естественных врагов вредителей, в то время как эмамектин Бензоат + Индоксар Кондиционер 15% суспензия вызывает относительно больший ущерб естественным врагам.
Результаты амплификации ПЦР различных проб показали, что амплификационные фрагменты polh, lef-8 и lef-9 образцов 1, 2, 3 и 4 были последовательными и правильными по размеру.Продукты ПЦР полиэтилена, леф-8 и леф-9 гены были 0.54, 0.716, и 0,29 kb соответственно (рисунок 2), что доказывает, что AcMNPV обладает инсектицидной активностью против личинки spodoptera frugiperda.
Наконец, программное обеспечение DNAMAN 6.0 было использовано для выполнения выровнения последовательностей на усиленных фрагментах polh, lef-8 и le.f-9 в образцах 1, 2, 3 и 4 (рисунок 3).Результаты показали, что сходство между усиленными последовательностями, lef-8 и lef-9 в образцах 1, 2, 3 и 4 составляли 100%, что указывает на то, что образцы 1, 2, 3 и 4 происходят от одного и того же вируса AcMNPV.
AcMNPV - это вирусы, которые заражают организм насекомых через пищу.постепенно заражает все тело и в конечном итоге приводит к смертиРезультаты этого исследования показывают, что AcMNPV обладает хорошей биологической активностью против личинки Spodoptera frugiperda.соответственноСмешанная суспензия из 10 миллионов AcMNPV.Bt (1500 мл/хм)2Ученые обнаружили хорошие средние контрольные эффекты на 10 и 15 день после лечения, достигнув 68, 99 и 66, 87%, соответственно, и были безопасны для естественных врагов.скорость исследований и разработок должна быть ускорена, чтобы AcMNPV мог играть большую роль в биологическом контроле Spodoptera frugiperda10 миллионов AcMNPV.Bt суспензии, произведенной Wuhan Chuqiang Biotechnology Co., Ltd, представляет собой соединение AcMNPV и биопестицида Bacillus thuringiensis (Bt),который может значительно улучшить инсектицидную активность вирусаПоскольку Bt является инсектицидом широкого спектра действия с хорошей микробной инсектицидной активностью, когда AcMNPV сочетается с Bt, его токсичность должна значительно улучшиться по сравнению с одной формулой..Это не только расширяет инсектицидный диапазон Bt, но и повышает его токсичность, достигая цели использования одной формулы для борьбы с несколькими вредителями.Это также причина, по которой приостановка 10 миллионов AcMNPV.Bt можно широко продвигать в овощах, фруктовых деревьях и рисе. Поэтому 10 миллионов AcMNPV.Bt можно продвигать в качестве зеленого средства борьбы с Spodoptera frugiperda в кукурузе
В этом исследовании при проведении полевых испытаний эффективности в случае быстрого снижения популяции насекомых в контрольной зоне (скорость снижения насекомых на 15-й день достигла 47,00%),средний контрольный эффект 10 миллионов AcMNPV.Бт суспензия (1500 мл/мм)2В то время как средний эффект контроля химического пестицида 15% метоксазол · индефенкарб SC (300 мл/см) был выше, чем у других препаратов.2В течение 15 дней после лечения показатель AcMNPV.Bt снижался до 51,60%.2) оказывает определенное воздействие на Spodoptera frugiperda с 10 по 15 день,учитывая медленную эффективность биологических пестицидов и короткую продолжительность жизни и перекрывающиеся поколения личинки Spodoptera frugiperda, рекомендуется увеличить количество исследований и продлить время исследования при проведении полевых испытаний эффективности биологических пестицидов (особенно вирусных препаратов),которые могут достичь более идеальных экспериментальных результатовВ целом, по сравнению с биологическими агентами, химические агенты обладают относительно более высоким эффектом уничтожения вредителей и действуют быстро.Они могут быть использованы в качестве чрезвычайной меры профилактики и борьбы во время вспышек вредителейПри относительно небольшом вреде вредителей биологические пестициды могут заменить химические пестициды в качестве одной из мер экологической профилактики и борьбы с ними.тем самым сокращение загрязнения окружающей среды и достижение эффекта защиты сельскохозяйственной экологии.
Кроме того, ген Polh (полиэдрин), используемый в этом исследовании, является типом полиэдрического промотора белка, он и P10 являются наиболее часто используемыми промоторами в системе векторов экспрессии бакуловируса (BEVS).оба высоко экспрессируются на поздней стадии вирусной инфекции[13]Однако активность промотора p10 ниже, чем у промотора polh, поэтому промотор polh часто используется для экспрессии экзогенных белков.Ген lef-8 может кодировать самую большую подединицу собственной РНК полимеразы вируса, и является типом фактора поздней экспрессии[14]. lef-9 является типом фактора поздней экспрессии, который кодирует подединицу белкового комплекса с lef-4, lef-8 и p47 в бакуловирусах.Исследования показали, что вирусы без гена lef-9 не могут генерировать вирусные частицы с инфекционной активностьюВ то время как вирусы с геном lef-9 могут восстановить инфекционную активность вируса, восстанавливая его.ген lef-9 является важным геном для бактериовируса для формирования BV (Budded Virus) с инфекционной активностью[15]Можно увидеть, что гены lef-8 и lef-9 имеют высокий консерватизм в различных типах вирусов ядерного полиэдроза,так что гены lef-8 и lef-9 могут быть использованы в качестве основы для идентификации типов вирусовПоэтому в этом исследовании использовались полих, леф-8 и леф-9 как объекты обнаружения, и благодаря выравниванию последовательности генов, гомология была высокой, все достигают 100%.Метод быстрого молекулярного обнаружения еще раз подтвердил, что AcMNPV обладает хорошей инсектицидной активностью против Spodoptera frugiperda, который подходит для дальнейшего продвижения и применения в профилактике и борьбе со Spodoptera frugiperda.
С 2019 года Spodoptera frugiperda вторглась в Китай и стала важным вредителем кукурузы.Вызывая огромные потери для кукурузной промышленности Китая и серьезно угрожая продовольственной безопасности Китая.[16]В связи с нынешней тяжелой ситуацией профилактики и борьбы с Spodoptera frugiperda в Китае,срочно необходимо ускорить скрининг и разработку эффективных пестицидов для профилактики и борьбы с Spodoptera frugiperda[17]Хотя вирусные инсектициды ограничивают их широкое применение из-за их медленной скорости действия и узкого спектра инсектицидов,в контексте повышения внимания к экологии и охране окружающей среды, инсектициды против бакуловирусов, как ожидается, будут все чаще использоваться в сельскохозяйственном производстве из-за их значительных преимуществ по сравнению с традиционными пестицидами.Из-за чувствительности препаратов вирусов насекомых к внешним условиям, таким как высокая температураПоэтому рекомендуется применять пестициды в пиковый период появления личинки вредителей.00 вечера в солнечные дни, чтобы избежать воздействия неблагоприятных условий окружающей среды, таких как высокая температура и свет, чтобы вирусная формула могла лучше выполнять свою роль и улучшать эффективность борьбы с вредителями.